电磁脉冲（electromagnetic pulse; EMP）是一种宽频、高能的电磁辐射，在日常生活和战争时期均能接触到[1]，对其生物学效应的研究也早已开展，为明确EMP是否造成淋巴细胞膜的损伤，本实验采用了原子力显微镜、电子自旋共振仪和流式细胞仪检测EMP辐照后 Jurkat细胞膜表面结构、细胞膜流动性、细胞膜表面蛋白结构和细胞内游离钙离子浓度的变化，从淋巴细胞膜方面探讨EMP作用的分子机制。
金华*王德文* 王水明彭瑞云高亚兵胡文华 李杨马俊杰
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京，100850 )
【摘要】
目的：
研究电磁脉冲（EMP）照射后淋巴细胞膜的变化。
方法：选定具有成熟的T淋巴细胞的表型特征的Jurkat细胞进行6×104V/m EMP辐照，原子力显微镜、电子自旋共振仪和流式细胞仪检测EMP辐照后Jurkat细胞膜表面结构、细胞膜流动性、细胞膜表面蛋白结构和细胞内游离钙离子浓度的变化，从淋巴细胞膜方面探讨EMP作用的分子机制。
结果：Jurka细胞内[Ca2+]i和细胞膜流动性增加，细胞膜电穿孔。
结论：6×104V/m EMP辐照后细胞膜损伤，细胞膜通透性升高，细胞内钙超载。
【关键词】 EMP；Jurkat；细胞膜；IFN-g；IL-4；
【中图分类号】 【文献标识码】
【文章编码】
The study of electromagnetic Pulse(EMP) on Jurkat cell membrane
JIN Hua, WANG Dew-Weng,PENG Rui-yun,WANG Shui-Ming,
GAO Ya-Bing, HU Wen-Hua,WANG Xiao-Min,Li Yang, MA Jun-Jie, (Institute
of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences,Bejing
100850,China)
【Abstract】:Objective: To study the effect of EMP on lymphocyte membrane. Methods: Jurkat cells were exposed to high power EMP of 6×104V/m as experimental models. By
various methods such as flow cytometry, electron spin resonance and
atom force microscopy, the structural effects of EMP on lymphocyte cellular membrane were investigated.Results: The [Ca2+]i and membrane fluidity of Jurkat cell increased obviously at 0h, there were perforation on cellular membrane.Conclusion: EMP can damage the lymphocytes membrane, membrane permeability increase and calcium overload in lymphocyte .
【Keywords】: EMP；Jurkat；membrane fluidity;membrane permeability; [Ca2+]i
电磁脉冲（electromagnetic pulse; EMP）是一种宽频、高能的电磁辐射，在日常生活和战争时期均能接触到[1]，
对其生物学效应的研究也早已开展，为明确EMP是否造成淋巴细胞膜的损伤，本实验采用了原子力显微镜、电子自旋共振仪和流式细胞仪检测EMP辐照后
Jurkat细胞膜表面结构、细胞膜流动性、细胞膜表面蛋白结构和细胞内游离钙离子浓度的变化，从淋巴细胞膜方面探讨EMP作用的分子机制。
1.材料与方法
1.1材料
Jurkat细胞由本院基础研究所郭宁教授惠赠，RPMI-1640购自
Sigma公司，小牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所。自旋标记物脂肪酸5-DS (5-doxyl-stearic
acid)，购自Sigma公司，膜蛋白标记物3-Mal，购自Aldrich公司。Fluo-3-AM荧光探针，购自Molecular
Probes公司，50μg溶于45μl DMSO(浓度1mM)，15μl/支分装，-20℃冻存备用。配制20mM的HEPES缓冲液，4℃保存。
1.2 方法
1.2.1 ESR法检测细胞膜流动性和含巯基蛋白结构变化[2]
常规培养细胞，辐照后即刻加适量自旋标记物5-DSA/马来酰亚胺Mal（终浓
度为0.2mmol/L），37℃孵育30min/4h，离心，沉淀吸入石英毛细管中置于样品腔中，进行ESR测试。检测条件：室温；X-波段；微波功率
P＝10mW；扫宽SW＝200Gs；中心磁场CF＝3470Gs；调频MF＝25KHz；调制幅度1G，扫描时间MA＝84s。参照文献计算膜脂序参数
(S)、旋转相关时间(τc)及强弱固定化组分比值S/W=hs/hw。
1.2.2原子力显微镜观察细胞膜表面结构的改变[3]
常规培养细胞，35mm塑料皿用多聚赖氨酸（100μg/ml）包被过夜，辐照后即刻用1.5%戊二醛固定20min，PBS轻洗两次。将样品粘至AFM的样品台，应用原子力显微镜进行接触式连续扫描观察。SPM-offline2.2软件进行分析。
1.2.3流式细胞术检测细胞[Ca2+]i的变化
Jurakt细胞常规培养（2×106/ml），离心收集细胞，20mM HEPES缓冲液离心洗涤细胞，Fluo-3-AM（终浓度为5μM/ml）于37℃或室温暗视野孵育0.5~1h；HEPES缓冲液洗涤；加入0.5ml HEPES缓冲液上机测量。
1.2.4数据处理
文中数据均以均数±标准差表示。采用SPSS11.0统计软件对各组实验数据的均值进行Dunnett t 检验。与对照组比，*示P<0.05，**示P<0.01。
2.结果
2.1 EMP辐照后Jurkat细胞膜流动性的变化
脂肪酸5-DSA标记细胞膜的典型ESR波谱如图2-1所示，S和τC计算公式如下[4]：
图2-1 脂肪酸5-DSA标记细胞膜的典型ESR波谱图
S=0.568×(T∥－T⊥)/a′， a′=( T∥＋2T⊥)/3
τc=3.418×10﹣10×△H0×﹛〔h﹙0〕/h﹙-1〕〕1/2－〔h﹙0〕/h﹙1〕〕1/2﹜
式中△H0为中场线宽度（高斯），h﹙1〕、h﹙0〕、h﹙-1〕分别为量子选择跃迁△M为1，0，﹣1时的谱线高度，其中T∥、T⊥分别为外、内超精细劈裂谱线的距离(单位为高斯G)。S的大小代表烃链的有序性，S=1表示完全有序，S=0表示完全无序，因此S值一般在0-1之间变化。旋转相关时间(τc)反映了脂质分子由一种构象向另一种构象转变所需要的时间。
EMP辐照后序参数和旋转相关时间均明显低于对照组(P<0.01、P<0.05)，Jurkat细胞所测ESR波谱如图2-2，序参数和旋转相关时间统计结果如图2-3所示。
2.2 Jurkat细胞膜含巯基蛋白质的变化
马来酰亚胺Mal-1标记细胞膜上蛋白巯基的典型ESR波谱图如图2-4，图2-5显示Mal-1标记Jurkat细胞后所示ESR波谱。图像表明细胞膜上的蛋白质巯基基团主要分布在膜的表层，而且EMP辐照后含巯基蛋白质构象未发生显著改变。
图2-4 Mal-1标记细胞膜上含巯基蛋白质的典型ESR波谱图
2.4 EMP辐照后Jurkat细胞[Ca2+]i变化
EMP辐照即刻Jurkat细胞内游离钙离子浓度明显升高（P<0.01）[图2-8]。
3．讨论
EMP辐射对细胞膜流动性和膜上含巯基蛋白质结构的影响
膜流动性是反映细胞功能的一种重要而敏感的指标。许多损伤在其病理发展的过程中都表现
出细胞膜流动性的变化。脂肪酸标记物5-DSA是带有氮氧自由基基团的一类标记物，可以插入细胞膜类脂双层骨架的极性部位，经ESR波谱仪在一定的参数条
件下，测定出特征性的波谱，根据波谱可计算出序参数(S)和旋转相关时间(τc)。S值反映了5-DSA氮氧自由基附近膜脂的有序程度高低和流动性的大小，S值升高表明膜脂排列更加有序，即流动性降低，反之则升高。旋转相关时间(τc)反映了脂质分子由一种构象向另一种构象转变所需要的时间，即反映了标记物5-DS附近膜脂的微观粘度，旋转相关时间增加表明膜脂的微观粘度升高，也即其流动性降低[4]。
本研究结果显示，EMP辐照后Jurkat细胞膜的特征性波谱中序参数S值非常显著低于对照组(P<0.01)，旋转相关时间τc也显著低于对照组(P<0.05)，表明EMP辐照后Jurkat细胞膜膜脂有序性下降和微观粘度降低，即细胞膜的流动性升高。
细胞膜蛋白质巯基与很多生物膜的重要生理现象及细胞膜的疾病有关[5、6]，例如葡萄糖运输的抑制与红细胞膜表面巯基有关，阳离子穿越细胞膜的运输与细胞膜内巯基有关。标记物马来酰亚胺Mal-1可以和膜蛋白巯基专一性结合，并产生弱固定化和强固定化两种ESR谱线，实际ESR谱为二者的迭加，弱固定化和强固定化两种ESR谱线分别反映了膜表层结合的自旋标记物和膜内部结合的自旋标记物的运动状态，蛋白质构象的变化会使强弱固定化组分比值，即S/W=hs/hw改变，同样也会使旋转相关时间τc发生改变，此外，还可通过蛋白质巯基标记知道膜上蛋白质镶嵌的深度[7]。
因为自旋标记物开始结合的是膜蛋白表面结构上的巯基，从本实验波谱图上看出照射前后ESR波谱并没有明显变化，强固定化成分S和弱固定化成分W均不明显，从波谱上无法计算hs/hw和τc，因此推断EMP辐照前后Jurkat膜上含巯基蛋白质的分布无明显变化，提示EMP辐照对Jurkat细胞膜上的含巯基蛋白质结构没有产生明显影响，而且细胞膜上含巯基蛋白质多在细胞膜浅表。文献表明电离辐照对膜蛋白的影响可使蛋白旋转相关时间τc下降，可能是由于电离辐照的能量较高，可以引起膜蛋白肽链断裂、蛋白质降解或交联[8]。本实验结果表明EMP辐照并不能引起含巯基膜蛋白肽链断裂、蛋白质降解或交联。
总之，EMP辐照后Jurkat细胞膜流动性增高，但膜上含巯基蛋白质结构未见明显变化，在证实了细胞膜是EMP作用靶部位的基础上提示，EMP辐照后Jurkat细胞膜脂的侧向和翻转扩散，甚至膜的相可能发生了转变，而膜上含巯基蛋白质不受影响，至于膜上其它蛋白质是否受EMP的影响还有待于今后深入研究。
细胞膜流动性的增加，对细胞周期有一定的影响[9、10]，并造成细胞增殖明显受到抑制，研究表明如果细胞膜流动性增强，S期细胞就会减少，滞留于G2/M与G0/G1期的细胞相对增多，细胞膜流动性增强阻止了G1期细胞向S期移行，反映了DNA合成受阻。前期研究工作已证实EMP可使细胞增殖活性明显下降，EMP辐照后6h-12h，G0/G1期明显高于对照组，推测EMP可能影响了Jurkat细胞膜的有序性，使细胞膜流动性增加，从而通过影响Jurkat细胞膜的生物物理特性，引起一系列后续细胞功能的变化，最终导致细胞G1-S期转换受阻，S期细胞减少，DNA合成受阻，细胞增殖受到抑制。
EMP辐射对细胞膜表面结构的影响
原子力显微镜是一种能够以纳米的分辨率产生三维表面分子结构的图像的新型仪器，为精密观察分子世界提供了一种全新的方法，在DNA表面结构、络合(作用)；核酸结构；蛋白质结构、蛋白质结合；生物膜、酶结构等的研究中，其应用已获得巨大进展[11]。
本研究利用原子力显微镜首次对EMP辐照前后Jurkat细胞膜表面结构进行观察，对
照组细胞膜表面基本平滑，少有轻度凹陷。EMP辐照后即刻于细胞膜表面见大小不一、深浅不一、多呈类圆形或不规则形的穿孔，孔径最大达到287.69
nm×240.5nm×281.178nm，表明EMP可直接导致Jurkat细胞膜电穿孔，细胞膜结构损伤，细胞内外液中各种离子和酶顺浓度梯度大量漏
出或内流，从而破坏了细胞内外液离子浓度和酶活性的平衡，尤其一些重要的离子如钙离子，引发胞外钙内流导致胞内钙超载，钙超载是细胞损伤、死亡的主要机制之一[12、13]，能够直接导致细胞损伤、死亡。
EMP辐射对Jurkat细胞内钙离子浓度的影响
Ca2+作为细胞内的第二信使，在维持细胞增殖、分裂、能量代谢等方面发挥重要作用[14]。在正常情况下细胞内Ca2+的浓度处于极为严格的调节控制之中，胞内 “钙库”(如线粒体和内质网)和胞膜上的钙转移系统(如Ca2+泵和Na+-Ca2+交换器)相互协调，质膜上的钙转移系统使Ca2+排出或进入细胞，共同维持细胞内外的Ca2+浓度梯度，因此细胞膜结构的完整性对保持细胞内低钙的状态起着重要的作用。
本研究应用Fluo-3对EMP辐照前后Jurkat细胞内游离钙离子浓度的检测发现，在EMP辐照后即刻Jurkat细胞内的钙离子即明显升高（P<0.01），提示细胞膜的完整结构受到破坏，说明EMP引起了钙超载，引发死亡通路被激活，导致系列细胞损伤效应如增殖活性下降、大量凋亡伴坏死、细胞通透性升高和信号转导异常等。
EMP辐照后Jurkat细胞内游离钙离子浓度明显升高(P<0.01)，不仅解释电磁辐射非热效应中的“细胞钙通道异常和钙离子浓度失衡致伤学说”，而且与前述EMP辐照后Jurkat细胞即刻细胞膜流动性增加和电穿孔的形成相吻合，表明细胞膜流动性升高和电穿孔形成是造成细胞内钙超载的原因之一，或由于细胞内钙超载促进了细胞膜流动性升高和电穿孔的形成，而细胞内钙超载是否是还源于胞内钙库的释放还有待于进一步探讨。
结合前述研究工作，我们认为EMP可直接损伤淋巴细胞膜，出现细胞膜流动性增加、电穿孔、细胞内酶AST和LDH异常外溢；同时，细胞膜损伤还可导致细胞内钙超载，影响细胞内外信号转导，干扰细胞增殖、分裂、能量代谢过程，导致损伤进一步加重。
参考文献
[1] Quaglino
D, Capri M, Zecca L, Franceschi C, Ronchetti IP. The effect on rat
thymocytes of the simultaneous in vivo exposure to 50-Hz electric and
magnetic field and to continuous light. ScientificWorldJournal. 2004
Oct 20; 4 Suppl 2:91-9.
[2] 赵梅兰，王德文，曹晓哲．电磁脉冲辐照对海马神经元膜流动性的影响．中国医学物理学杂志，2001，18(3)：171-175
[3] 曹晓哲，王德文，赵梅兰等．电磁脉冲辐照所致下丘脑神经细胞膜穿孔的原子力显微镜研究．军事医学科学院院刊， 2003，(6)： 416-418.
[4] 张建中，赵保路，张清刚编著． 自旋标记ESR波谱的基本理论和应用． 科学出版社 1987，199－200，407-411.
[5] 张之南等．Chinese Medical Journal，1981（4），94， 207
[6] 赵保路，析文娟，周凤兰，潘华珍．生物化学与生物物理学报，1985，17（2），175
[7] 华玥，程时，卢景雾，杨正红．金属硫蛋白对大鼠心肌细胞羟自由基损伤保护作用的自旋标记．研究.科学通报，1992（13），1217－1219
[8] 程龙生，唐祥，郑建华．竹红菌甲素对人红细胞膜光损伤的ESR研究．生物化学与生物物理学报，1988（20），155
[9] Yao W, Gu
L, Sun D, Ka W, Wen Z, Chien S. Wild type p53 gene causes
reorganization of cytoskeleton and, therefore, the impaired
deformability and difficult migration of murine erythroleukemia cells.
Cell Motil Cytoskeleton. 2003 Sep；56(1):1-12.
[10] Perez FR,
Pineiro V, De La Cruz LF, Casanueva FF, Casabiell X. Vascular wall:
potential target for the physicochemical effects of cis-unsaturated
free fatty acids. Microsc Res Tech. 2003 Jan 1；60(1):23-9.
[11] Mark A. Poggi, Lawrence A. Bottomley, Peter T. Lillehei. Scanning Probe Microscopy .Anal. Chem.2002, 74,2851-2862
[12] Rizzuto R, Pinton P, Ferrari D, et al. Calcium and apoptosis: facts and hypotheses. Oncogene, 2003,22(53): 8619-8627.
[13] Oakes SA,
Opferman JT, Pozzan T, et al. Regulation of endoplasmic reticulum Ca2+
dynamics by proapoptotic BCL-2 family members. Biochem Pharmacol, 2003,
66(8): 1335-1340.
[14] 孙大业，郭艳林，马力耕．细胞信号转导． 第二版 1996，91－127
作者简介:金华(1770-),女,汉,贵州省毕节县,博士,主治医师
通讯作者:王德文,北京市海淀区太平路27号院二所八室,100850
