金华 王德文* 彭瑞云 李杨 王水明 高亚兵 胡文华 王晓民 马俊杰 (军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京，100850 )

摘要：目的 利用在体动物模型研究镀铜织物EM-4屏蔽布对电磁脉冲(EMP)辐照后免疫组织的防护效果，并在离体Jurkat细胞损伤模型上探讨药物防治的可能性。方法 选定Wistar大鼠和Jurkat细胞进行6×10⁴V/m EMP辐照，复制动物模型和细胞模型，应用血生化分析、光镜观察、MTT法、流式细胞术检测EMP对大鼠外周血淋巴细胞计数、脾脏和胸腺组织形态及Jurkat细胞的增殖活性、细胞周期等的影响。结果 ⑴EM-4屏蔽布防护组大鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数在照后恢复快于无防护组。⑵4,5,7三羟异黄酮能部分阻断EMP辐射对Jurkat细胞增殖的抑制和S期细胞的减少。结论 物理金属网电磁屏蔽布（EM-4）和蛋白酪氨激酶(PTK)抑制剂4,5,7三羟异黄酮对6×10⁴V/m EMP所致细胞免疫功能损伤、细胞增殖活力下降及离体细胞DNA合成受阻有一定防护效果。

The protection research on damage of immune organization and cell after electromagnetic pulse (EMP)

JIN Hua, WANG DeWeng, PENG RuiYun, et al. (Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences,Bejing 100850,China)

【Abstract】:Objective: To study the protection effect of metal net-like defense cloth in vivo and genistein on Jurkat cell after electromagnetic pulse (EMP) . Methods: Wistar rats and Jurkat cells were exposed to high power EMP of 6×10⁴V/m as experimental models. By various methods such as biochemical tests, light microscopy, MTT, flow cytometry, the protection effect of metal net-like defense cloth and PTK inhibitor Genistein on peripheral blood lymphocyte count of rat , morphous of spleen and thymus, proliferation activity and cell cycle were investigated. Results: (1) Peripheral blood lymphocyte of rats sheltered with EM-4 recovered more quickly than that of rats unsheltered; (2) Pretreatment with gensitein could partially block the degression of EMP on the proliferation activity and Jurkat cell in S phase instantly; Conclusion: The metal net-like defense cloth (EM-4) and PTK inhibitor Genistein are effective to protect the immune function , cell proliferation activity and DNA synthesis from EMP radiation.

【Keywords】: EMP；immune；prevention；genistein；

电磁脉冲（electromagnetic pulse;　EMP）是一种宽频、高能的电磁辐射，在日常生活和战争时期均能接触到，对其生物学效应的研究也早已开展，近年来，电磁辐射对免疫系统生物效应的研究日益受到重视，并取得一定进展^[2]，但对于其损伤防护的研究报道甚少^[1～3]。本实验拟在在体动物模型上研究镀铜织物EM-4屏蔽布对EMP辐照后免疫组织的防护效果，并在离体Jurkat细胞损伤模型上探讨药物防治的可能性。

军队项目：全军指令性课题

[作者简介]金华（1970－），女，汉族，贵州省毕节县人，博士研究生（2002.8-2005.7）,研究方向:免疫病理学，现为解放军263医院病理科主治医师,电话 66856069。

* 通讯联系人 王德文, 男, 博士导师, 研究方向: 军事病理学, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 实验病理学研究室, 电话 66931336

1.材料与方法

1.1材料

Jurkat细胞由本院基础研究所郭宁教授惠赠，RPMI-1640、PI、二甲基亚砜(DMSO)和Genistein购自Sigma公司，Genistein用DMSO溶解，配制成100mmol/L的贮液在-20℃保存备用。二级雄性Wistar大鼠115只，体重(236.29±20.07)g，军事医学科学院动物中心提供并饲养。EMP辐照源及电磁波实验室由国防科技大学理学院研制，动物辐照由军事医学科学院放射与辐射医学研究所全军新武器生物效应实验室实施。镀铜织物EM-4屏蔽布由上海纺织科学研究院研制。噻唑蓝（MTT）购自GIBCO公司，临用前配制浓度为5mg/ml；三联液：10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L HCl（w/v/v）。

1.2方法

1.2.1在体动物模型物理防护试验：大鼠随机分为对照组15只、照射组和防护组各30只。照射组设6个时间点(辐照后6h、1、3、7、14和28d)，对照组3个时间点(3、14和28d)，每个时间点每组为5只。Coulter-JTIR全自动生化仪检测外周血白细胞和淋巴细胞计数。剩余40只，随机分为对照组(20只)、照射组(20只)，在辐照后3、6、9和12m只进行病理形态学观察。辐照后动物常规饲养。经照射后各个时相点，取新鲜脾脏和胸腺组织，迅速浸入4%中性甲醛液固定，石蜡包埋，H.E染色，光镜观察。

1.2.2 Genistein对EMP辐照所致细胞增殖活性下降的干预实验: 细胞分为假辐照组、EMP辐照组、EMP辐照+Genistein组。参考汪涌等的方法^[4～6]，并结合产品说明书，在辐照前30min按相应的组别加入Genistein，终浓度为100μmol/L，其余步骤参见周建军等^[1～3]报道方法并加以改进。

1.2.3 Genistein对EMP辐照所致细胞周期紊乱的干预实验: 实验分组同前，参见司徒镇强等^[4]报道方法并加以改进。辐照后6h收集细胞，加300l 5％小牛血清PBS和700l无水乙醇，-20℃固定24h以上,测定前加RnaseA(1mg/ml)200l，37℃水浴30min后加入PI(100g/ml)300l，暗处染色20min，FCM检测G₀/G₁、S和G₂/M期的细胞数和各期总体积的百分比。

1.2.4数据处理:文中数据均以均数±标准差表示。采用SPSS11.0统计软件对各组实验数据的均值进行Dunnett t 检验。

2.结果

2.1 EM-4屏蔽布防护效果

经EM-4屏蔽布防护后，大鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数在照后7d高于对照组 (P<0.05)，并在7、14d时较无防护组有增高趋势(P>0.05)，28d时恢复至对照组水平(表1、表2)，但其它指标未发现明显变化。

表1 EMP辐照后大鼠外周血白细胞计数变化(×10⁹/L)

与对照组比，^a示P<0.05，^b示P<0.01

表2 EMP辐照后大鼠外周血淋巴细胞计数变化(×10⁹/L)

与对照组比，^a示P<0.05，^b示P<0.01

光镜下防护组所见同辐照组。有如下病理学变化：脾脏和胸腺组织形态破坏，脾脏红白髓界限模糊，红髓充血，巨噬细胞增多；胸腺皮髓质比例倒置，皮质变薄，髓质变宽，间质灶状出血；脾脏和胸腺实质都出现了淋巴细胞凋亡、坏死，且病变均有缓慢性及可恢复性特点，间质后期均发生纤维化，结构重建不良。

2.2 Genistein对EMP辐照后细胞增殖活性下降的干预作用

辐照即刻Genistein处理组细胞增殖活性为1.393±0.051，明显高于单纯EMP辐照组（1.329±0.031）(P<0.01)，略高于正常对照组（1.401±0.029），但无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Genistein对EMP辐照后细胞周期紊乱的干预作用

Jurkat细胞对照组S期细胞所占百分比为28.327±0.085，经EMP辐照后6h Genistein处理组升高至对照组水平，为28.253±0.199，高于单纯EMP辐照组（26.95±0.563） (P<0.05)。

3.讨论

迄今为止，对电磁辐射的防护形式多种多样，但基本原则不外乎两方面，即针对辐照源采取的防护措施和针对作业人员操作部位环境采取的防护措施，后者包括物理防护与药物防护，物理防护主要为作业人员（即电磁波源作业人员，作战人员和其他受到辐照的人员）提供必要的个人防护用具。EM-4屏蔽布是由上海纺织科学研究院研制的镀铜织物，这种镀金属纤维可以纺织出任何规格的防护服、帽及面罩等。其防护原理是尽量增加电磁波在其中的衰减，以便把入射到人体的场强和功率密度降低到电磁辐射卫生标准以下从而达到防护目的。为观察物理防护布对免疫系统是否具有防护效应，且防护效果如何，本研究采用金属网电磁屏蔽布对预受辐照的大鼠进行全身遮盖。研究显示，防护组大鼠外周血白细胞数和淋巴细胞数在照后7d恢复快于照射组，说明防护布有一定的防护效应，但尚未达到完全防护的目标。本室既往研究已发现，该特制电磁屏蔽布对EMP致内分泌器官、心脏和中枢神经系统等损伤有一定的防护作用。表明针对EMP的防护措施的研制亟需加强。

关于药物防治EMP所致细胞免疫功能下降的研究，国内未见报道。物理防护主要目的在于避免或减少电磁波的辐照，而通过药物阻断发病途径进而防治EMP损伤不仅立足于“防”，而且对损伤具有早期治疗的可能性，因而药物干预实验的探索，不仅具有应用前景意义，对进一步印证阐明其机制，也有理论意义。有学者用药物对实验动物受电磁辐射进行了预防效应检测，发现某些药物如卡尼汀可以改善由于电磁辐射而造成的对免疫系统的损伤，但也是未能达到完全的预防效应^[7、8]。本研究前述实验结果表明，TCRα/β﹠CD28通路信号转导在EMP辐照后早期过度激活，促进了胞内钙库的释放，加重了细胞内的钙超载，使细胞的损伤更为严重。因此本实验从阻断发病途径这一角度，应用PTK抑制剂Genistein对EMP致Jurkat细胞损伤进行干预，探索药物防治EMP辐照对免疫系统损伤的可能性。

前部分实验证实，6×10⁴V/m EMP能下调淋巴细胞增殖活性，造成细胞周期紊乱，G₁期阻滞和S期延迟，DNA 合成受阻，并且介导T细胞活化的TCRα/β﹠CD28通路信号转导“失常”是EMP辐照后期T淋巴细胞功能损伤和细胞免疫应答下降的重要原因。在TCRα/β﹠CD28信号通路中，TCRα/β﹠CD28、PTK、PKC和[Ca²⁺]_i是关键的信号转导分子，实验结果显示在辐照后即刻TCRα/β﹠CD28信号通路即被过度激活，TCRα/β﹠CD28表达、PTK活性明显上升，继之引发PKC活性和细胞内钙离子浓度的升高，从而引起一系列的细胞损伤效应。因此如果能降低EMP辐照后即刻信号转导途径中PTK的活性，就有可能减轻EMP对Jurkat细胞的损伤。

Genistein是一种特异性酪氨激酶抑制剂^[9～13]，是从食用大豆中提取的4，5，7 三羟异黄酮，在体外和细胞整体水平研究中，Genistein特异性抑制生长因子受体型酪氨酸激酶(RPTK)以及非受体型酪氨酸激酶(NRPTK)中src癌基因家族的活性。而其他酪氨酸激酶抑制剂可能在细胞整体水平上丧失抑制作用。Genistein除了具有PTK抑制作用以外，尚具有部分抑制PKC激酶、拓扑异构酶Ⅱ、S6激酶作用、雌激素样或抗雌激素样效应和抗氧化剂作用。因为酪氨酸蛋白残基的磷酸化广泛存在于细胞的各种生理过程中，所以Genistein还能调节细胞的多种生理功能，如细胞周期的调节、细胞增殖和分化、凋亡、细胞的黏附和迁移、血管的发生等，除此之外Genistein还能降低胞外钙内流和胞内钙释放^[14]。

MTT测试结果显示，在辐照后即刻Genistein处理组细胞增殖活性均明显高于单纯EMP辐照组(P<0.01)，虽然仍略低于正常对照组，但无统计学意义(P>0.05)，表明Genistein对EMP辐照有明显防治作用，推测Genistein抑制PTK，从而直接阻断细胞内钙库的释放，减少胞内钙超载，缓解EMP所引起的细胞增殖活力下降。另一方面再次证实PTK活性的升高参与了EMP所致的Jurkat细胞增殖活性的下降。

流式细胞术测试结果显示，EMP辐照后6h Genistein处理组Jurkat S期细胞升高至对照组水平，高于单纯EMP辐照组(P<0.05)。提示Geninstein对EMP辐照引起的离体细胞DNA合成受阻具有防护作用。

上述结果进一步表明了TCRα/β﹠CD28信号通路在EMP致Jurkat细胞损伤机制中的重要作用。为进一步开展EMP损伤的药物防护及早期治疗研究提供了新思路，并奠定了一定的实验基础。

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作者简介：姓名 金华，性别 女， 民族 汉，籍贯 贵州省毕节县，

职称 主治医师，学位博士研究生，

从事专业 诊断病理， 主要研究方向 免疫病理学

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