摘要：鸡胚的原代成纤维细胞受4000v/m电场和0.1G磁场的模拟高压输电线路电磁辐射系统照射后，应用MTT方法检测细胞增殖的情况，结果表明：电磁场作用后的细胞，随照射时间的增加，与对照组相比细胞数目递减，抑制了细胞的增殖。说明高压输电线电磁辐射抑制了成纤维细胞的增殖，其生物学效应的一个重要方面表现在对细胞增殖的影响上。

关键词：高压输电线 电磁辐射 MTT法 细胞增殖

The Effect of Electromagnetic Radiation For High-Voltage Power line on the Proliferation of Embryo Fibroblast

Liu lewei Pang xiaofeng

Institute of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology

of China, Chengdu 610054, Sichuan , China

Abstract: Chick embryo fibroblast (CEF) was exposed to the electromagnetic radiation created by high-voltage transmission line at 4000v/m and 0.1G for different time. The method of MTT was employed to evaluate the level of proliferation. The result show that the proliferation of CEF was inhibited by the electromagnetic field, and with the increase of the time of irradiation, the number of the CEF cell were descending. Expose to the electromagnetic field created by high –voltage transmission line could restrain the proliferation of CEF in vitro, which indicate that one of the important biological effects of the EMF is to inhibit the cellular proliferation.

Key words: High-Voltage Transmission; Electromagnetic radiation; MTT; Proliferation

1. 前言

我们的生活环境中存在着各种电磁场，世界上每个人都暴露在范围为0-300GHz的混合电磁场中，随着技术革命的继续和频谱不同部分的新的应用的发现，很多频率的暴露水平也在显著增加。无论是发达国家还是发展中国家，人们都在关注由此带来的可能对人类健康造成的潜在的危害。一些病理学上的研究发现，高压输电线周围的居民癌症的发病率较高可能与电磁场的辐射有关。与此同时，人们又发现，一定强度的低频交变或脉冲电磁场能够促进患者骨折的愈合，电磁场作为促进骨修复的一种方法已广泛应用与临床。但是电磁场的作用机理还不很清楚。电力的产生，分布，使用和传输系统作为环境电磁场的主要来源之一。细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位,生物体的新陈代谢和在此基础上所表现的生长、发育、繁殖、遗传与变异以及一切生命活动都是在细胞内或在细胞基础上进行的。因此,许多电磁场对生物体的作用的研究也是以细胞为基础,通过对细胞的研究进而探讨对生物个体的作用及其作用机制。因此，本文搭建了一个高压输电线路电磁辐射系统用于模拟生活中的电磁场，来研究高压输电线路电磁辐射对成纤维细胞增殖的影响，为进一步研究电磁场生物学效应的机理提供一定理论基础。

2.实验材料和方法

实验用的主要试剂与仪器有RPMI1640培养基（Hyclone公司）,小牛血清（郑州佰安生物工程有限公司），噻唑蓝（MTT，Amersco公司），二甲基亚砜（DMSO，分析纯，SIMGA公司），0.22µm一次性正压过滤器（MILLIPORE公司），96孔酶标板（Costar公司），二氧化碳孵育箱（Thermo Electron 公司），倒置显微镜（IX71，Olympus公司），酶联免疫检测仪（Sunrise, TECAN公司）。

本课题组通过实地测量得到：距离地面1.6m到2.2m的场强分布大约是3500－4100v/m和1高斯左右。电磁场由我们实验室搭建的高压输电线路电磁辐射系统产生，电场强度为4000v/m,磁场强度为0.1G。电场为高压直流产生，脉冲磁场作用装置由Helmholtz线圈和脉冲电源两部分组成，其频率0～1MHz可调，电流0～0.6A可调的正弦交变电流。在本试验中通以0.4A的电流，产生0.1G的磁场进行照射。

实验中取9d健康鸡胚，无菌去处头爪和内脏，并剪成块。用Hank’s液充分冲洗后，移入广口瓶中，用眼科剪将其剪成1立方毫米大小的碎块，加入Hanks液充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液，反复冲洗2－3次后，吸弃上清液。取0.25%胰酶洗一次，吸弃后于沉淀组织块内加约5－10倍量的0.25％胰酶，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。取出后小心吸弃上层胰酶溶液，加入含小牛血清的RPMI1640培养液中止消化。轻洗两次后，即在洗液中以大口吸管反复吹打瓶壁至液体变浑浊。用300目尼龙网过滤以去除细胞团块。制成细胞悬液后，计数。用含10%小牛血清的RMPI1640培养液培养于37℃,5%CO培养箱中，2－3日换液。

待细胞贴壁后，用胰酶消化成细胞悬液，洗涤，计数。将细胞按0，0.5, 1, 2, 4 , 8 , 12,16×10/ml浓度各200μl接种于96孔培养板上，待细胞贴壁后，各小孔分别加入20μl/孔MTT溶液（5mg/ml）. 然后将培养板送回培养箱内培养4h．取出培养板后，小心吸尽孔内培养液，加入150µl二甲基亚砜(DMSO)，振摇培养板10min左右．最后用酶联免疫检测仪测定光密度(490nm)，做出光密度与细胞存活总数的标准曲线．根据MTT标准曲线．可得到各细胞的最佳接种浓度．将对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，按其最佳浓度接种于96孔板内，在模拟的高压输电线电磁辐射环境下分别辐照了20，40，60，80，100min，对照组置于附近相同环境条件下，但无电磁场影响。然后在37℃,5%CO培养箱中继续培养24h，再按MTT的标准方法操作，检测细胞的增殖情况。

统计学处理采用SPSS软件进行 t 检验，检验水准α＝0.05.

3.实验结果

鸡胚原代成纤维细胞的最佳接种数目是4×10/ml，用MTT法进行检测，得到的490nmOD值光吸收值。其MTT检测结果（图1）表明，高压输电线电磁在辐射20分钟已明显抑制增殖，光吸收度从对照组的0.426下降到试验组的0.386,变化百分率是－9.4%,且随着照射时间得增加抑制程度加剧(见表一)。

图 1 MTT法检测高压输电线电磁辐射对原代成纤维细胞的影响 ，

照射时间越长，细胞调亡数越多（n＝7，P<0.01）

                 表1 高压输电线电磁场对细胞的作用（X±S）

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->                        高压输电线电磁场处理时间 （minute）

试验方法与步骤是随机取试验组及对照组大鼠各八只，断头处死，迅速取出脑，在低温修块台上分离出双侧海马组织，剪碎后，将海马组织移至3ml含0．25％胰蛋白酶的冰冷Hanks平衡盐溶液(NaCl 137mmol／L，KCl 5mmol／L，Na2HPO4 0．3mmol/L，糖6mmol/L，HEPE 10mmol/L)中，在37℃水浴中消化30min。然后用10％牛血清终止反应。将经过消化的海马组织分别用端口为500μm、200μm、100μm的玻璃吸管依次轻轻分离，至组织呈粘稠状；然后在室温下静置10min，用移液枪吸取30μl悬浮液，700rpm，3min离心甩片。再用 4％多聚甲醛固定15min，PBS冲洗5min，共3次。10％TritonX－100 4℃下3－5min打孔，PBS冲洗5min，共3次。擦干水痕，加Fluo－3（1：200）37℃避光孵育40min，PBS冲洗3次，每次5min。10％甘油封片。荧光显微镜下检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜(Bio—RadMRC—1024型，美国)，激发光选用488nm、发射光530nm。将载有样品的玻片固定在显微镜载物台上，在40倍显微镜下，对不同视野神经细胞进行激光扫描观察细胞内[Ca2+]i，数据为细胞内荧光像素的相对值。

实验数据用x±s 表示，采用SPSS软件进行单因素方差分析及均数间两两比较.p<0.05,认为有显著性差异；p<0.01认为差异非常显著。试验结果表明:

在荧光显微镜镜检时,发现细胞悬浮液中细胞形态不清楚，不能观测到明显的神经元的树突和轴突，难以分辨出神经元细胞。重复试验两次仍不能观测到清晰的细胞形态，如图23所示。故无法进行激光共聚焦检测，试验中止，专家认为在活体动物直接提取的细胞很难分辨出神经元细胞，难以确定细胞位置。一般实验都是采取离体细胞培养成细胞爬片染色后来观察能得到较理想的结果。

图23.(a) 在荧光显微镜200×下观测的结果 ,(b)在相干显微镜200×下观测结果

我们分析该实验失败原因有下面几点：1.可能胰酶过度消化，已将树突及轴突消化。2.可能在机械分离过程中将细胞破碎，导致细胞形态不清楚。3.应多次离心洗涤去处蛋白本底。我们认为采取下述方法有可能改进：1.可采取细胞爬片后进行Fluo－3荧光染色。2.应采取更加成熟的protocol。

5.讨论

高压输电线电磁场对成纤维细胞分别作用了20，60，80，100分钟，随着电磁场作用时间的延长，试验组细胞增殖明显受到了抑制，P<0.01。抑制程度随作用时间的增加而增强，抑制百分率分别为9.6%,14.3%,15.6%,16.5%,17.5%。抑制百分率随时间的延长变化平缓，说明高压输电线对细胞的抑制不会随时间的延长而无限的增强，超过一定的时间，抑制作用将趋于平缓。

高压输电线电磁场包括了电场和磁场，其产生的生物效应可能是电场和磁场的综合作用 结果，从其对体外细胞短时间作用即明显抑制了细胞的增殖来看，可能是细胞增长与细胞增殖的综合体现。电磁场作用可能激活了细胞的调亡信号，细胞膜以及膜上 的受体可能是电磁场作用的位点，通过它们的信号介导作用，使细胞内的cAMP水平改变而促发一系列的磷酸化生物信号放大反应，进而调控细胞的增殖水平，引起生物效应。也可能增加钙离子内流，调节胞内钙离子浓度，通过钙离子的第二信使作用改变细胞行为.

通过体外原代细胞培养，设计模拟高压输电线电磁场系统试验，观察到其电磁场能够抑 制成纤维细胞的增殖。从细胞水平说明了高压输电线的生物效应，为进一步研究高压输电线对人体的作用做一定的试验准备。高压输电线电磁场对细胞作用的生物学 机制尚需进一步讨论，其如何抑制细胞增殖，有待我们继续探索。

参考文献

1. Farrell M, Barber M et al. Effect of low frequency electromagnetic fields in developing chicken embryos. Bioelectrochemistry and Bioenergetics,1997,43:91-96

2. Repacholi MH. Low-level exposure to radiofrequency electromagnetic field: Health effects and research needs. Bioelectromagnetics 1998,19:1-19

3. Repacholi MH，Greenbaum B. Interaction of static and extremely low frequency electric and magnetic field with living systems: Health effects and research needs. Bioelectromagnetics 1999,20:133-160

4. E Litvak, KR Foster，MH Repacholi. Health and safety implications of exposure to electromagnetic fields in the frequency range 300 Hz to 10MHz. Bioelectromagnetics 2002,23:68-82

5. Berg H, Forster W, Jacob H U, et al. Electric field effects on single cells. Studia Biophysics,1978,74:31

6. Peychting M, Ahlbon A. Magnetic fields and cancer in children residing near Swedish high-voltage power line. Am J Epidemiol.1993,138(7):467-481

7. Savliz D A, Wachtel H , Bames F, et al. Case-control study of childhood cancer and exposure to 60 Hz magnetic fields. Am J Epidemiol. 1988,128:21-38

8. Lee RC, Canaday DJ, Doong H. A review of the biophysical basis for the clinical application of electric fields in soft-tissue repair. J Burn Care Rehabil,1993,14:319-335

9. Pericles D, Kenji S,Kazuhiss, et al. Effects of pulsed electromagnetic field stimulation on bone tissue like formation are dependent on the maturation stages of the osyeoblast. Bioelectromagnetics,2002,23:398-405

10. Kverborg M, Flyvbjerg A, Eriksn EF, et al. Transforming growth factor-betal stimulates the production of insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor-binding protein-3 in human bone marrow stromal osteoblast progenitors. Endocrinol ,2001,169(3):549-561

11. 司徒镇强，吴军正．细胞培养．西安：世界图书出版西安公司，1996,186-187

12. 孙大业，郭艳林。细胞信号转导。北京：科学出版社。2001

13. Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, et al. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling. Exp Cell Res,2003.284(1):31-53

14. Panagopoulos DJ, Karebarbounis A, Margaritis LH. Mechanism for action of electromagnetic fields on cells. Biochem Biophys RES Commun. 2002,298:95-102

作者:

*庞小峰，教授。博士生导师, 男，主要研究分子生物学、生物电磁学和非线性科学。E-mail:pangxf2006@yahoo.com.cn

*感谢国家自然科学基金的资助， 基金编号：60241002。